Загальний огляд
FOXO4-DRI це синтетичний сенолітичний пептид з D-ретро-інверсо архітектурою, вперше описаний у 2017 році групою дослідників на базі Erasmus MC (Роттердам) у статті Baar та співавт. (журнал Cell)[1]. Його ключова властивість: здатність вибірково запускати апоптоз у сенесцентних («старіючих») клітинах шляхом руйнування внутрішньоклітинної взаємодії між білками FOXO4 і p53, яка в нормі утримує p53 у ядрі й блокує його проапоптотичну дію. Це не природна молекула, а раціонально сконструйований дослідницький інструмент.
Публікацію 2017 року варто розглядати як фармакологічний аналог більш раннього генетичного підходу: ще до появи FOXO4-DRI трансгенні мишачі моделі з індукованим видаленням p16Ink4a-позитивних сенесцентних клітин продемонстрували, що елімінація цієї клітинної популяції затримує розвиток вікозалежних порушень (детальніше: у розділі «Клітинне старіння: контекст»). FOXO4-DRI відтворює той самий принцип «вибіркового прибирання» сенесцентних клітин, але за допомогою пептиду, який можна вводити ін’єкційно, без генетичної модифікації тварини.
Після початкової публікації дослідницький інтерес до молекули не згас: протягом 2020–2026 років FOXO4-DRI застосовували в моделях вікового дефіциту тестостерону, клітинної біології хряща, келоїдного рубцювання та судинного старіння, а також використали як структурну основу для розробки наступного покоління пептидних інгібіторів взаємодії FOXO4-p53. Попри це, вся доказова база й донині залишається доклінічною, отриманою на культурах клітин людини, тканинних експлантах та гризунах. Контрольованих клінічних досліджень за участю людей не проводили, затвердженої людської дози не існує, а сама сполука має статус виключно дослідницького реагенту (RUO, research use only), не призначеного для застосування на людях чи тваринах.
Клітинне старіння: контекст
Клітинна сенесценція це стабільна, по суті незворотна зупинка клітинного циклу, яку клітина «обирає» у відповідь на різні типи стресу: критичне вкорочення теломер і реплікативне виснаження, активацію онкогенів, генотоксичне ушкодження ДНК (зокрема від цитостатичної хіміотерапії чи опромінення) або окислювальний стрес. Зупинка циклу реалізується через шляхи p16INK4a/Rb та p53/p21CIP1, а типовим біохімічним маркером слугує підвищена активність асоційованої з сенесценцією β-галактозидази (SA-β-gal). Принципово, що сенесцентна клітина не гине: вона залишається метаболічно активною й водночас набуває вираженої стійкості до апоптозу.
Крім стійкості до загибелі, сенесцентні клітини секретують так званий асоційований із сенесценцією секреторний фенотип (SASP): набір прозапальних цитокінів (IL-6, IL-1α/β, IL-8, TNF-α), матриксних металопротеїназ і ростових факторів, які змінюють мікрооточення тканини, залучають імунні клітини й здатні паракринно індукувати сенесценцію в сусідніх, до того здорових клітинах («ефект свідка»). Накопичення таких клітин зростає з віком практично в усіх тканинах і різко посилюється після гострих генотоксичних впливів, наприклад курсу хіміотерапії. Саме цю модель використали Baar та співавт. для тестування FOXO4-DRI (див. розділ «Доклінічні дослідження: in vivo»). Згідно з узагальненням огляду van Deursen (2014, Nature)[3], саме генетичні докази того, що усунення p16Ink4a-позитивних клітин затримує вікозалежну дисфункцію тканин, і стали концептуальною основою для пошуку фармакологічних («сенолітичних») засобів, здатних відтворити той самий ефект без генетичної модифікації.
У фармакологічній сенолітиці, за огляду Kirkland і Tchkonia (2020, Journal of Internal Medicine)[2], склалося декілька принципово різних підходів до вибіркового усунення сенесцентних клітин, які відрізняються мішенню і, відповідно, профілем обмежень.
| Клас сенолітика | Приклад | Мішень / механізм | Головне обмеження |
|---|---|---|---|
| Комбінація малих молекул («hit-and-run») | Дазатиніб + кверцетин | Одночасне пригнічення кількох антиапоптотичних сигнальних шляхів сенесцентних клітин (SCAP) | Багатомішеневий вплив; уже має пілотні дослідження за участю людей (напр., за ідіопатичного легеневого фіброзу), але з побічними ефектами вихідних препаратів |
| Інгібітори родини BCL-2/BCL-XL | Навітоклакс | Пряме пригнічення антиапоптотичних білків BCL-2/BCL-XL | BCL-XL підтримує також виживання тромбоцитів → тромбоцитопенія як прогнозована токсичність |
| Пептиди: руйнівники білок-білкової взаємодії | FOXO4-DRI | Вибіркове витіснення p53 з комплексу FOXO4-p53 | Вузькоспрямований механізм, але без жодних клінічних даних за участю людей |
Молекулярний механізм
У сенесцентних клітинах експресія транскрипційного фактора FOXO4 зростає, і його форкхед-домен (FHD) зв’язується з внутрішньо розупорядкованим N-кінцевим трансактиваційним доменом (TAD) білка p53.[9] Структурне картування цієї взаємодії (Zhang R. та співавт., 2023, Gene & Protein in Disease) показало, що для збереження більшої частини спорідненості зв’язування достатньо короткої ділянки форкхед-домену FOXO4 (приблизно позиції 101–109), утвореної переважно гідрофобними контактами. Саме цей мінімальний мотив розпізнавання і є структурною основою, яку відтворюють пептиди класу DRI. Утримуючи p53 у ядрі таким чином, FOXO4 перешкоджає його транслокації до мітохондрій і тим самим блокує внутрішній (мітохондріальний) шлях апоптозу, який в іншому випадку усунув би пошкоджену чи сенесцентну клітину. Фактично це і є молекулярна основа стійкості сенесцентних клітин до загибелі, яка дозволяє їм персистувати в тканині як «зомбі-клітини».
FOXO4-DRI, побудований на основі того самого розпізнавального фрагмента форкхед-домену FOXO4, конкурує за ту саму поверхню зв’язування на трансактиваційному домені p53 і витісняє ендогенний FOXO4 із комплексу. Вивільнений p53 виходить із ядра й перерозподіляється до мітохондрій, запускаючи каскад внутрішнього апоптозу: за даними Hu та співавт. на моделі сенесцентних ендотеліальних клітин, це супроводжується зсувом балансу проапоптотичного BAX і антиапоптотичного BCL2 на користь BAX, а також зростанням активної (розщепленої) каспази-3, фінальної ефекторної протеази апоптотичного каскаду.
Окремо задокументована роль фосфорильованих форм p53. В ендотеліальних клітинах, підданих окислювальному стресу, обробка FOXO4-DRI супроводжувалась зростанням фосфорилювання p53 за серином-46 одночасно з посиленим виходом білка з ядра (Hu та співавт., 2026).[7] У хронічно сенесцентних келоїдних фібробластах інша фосфорильована форма: p53, фосфорильований за серином-15 (p53-pS15), конститутивно підвищений разом із p16 у сенесцентному мікрооточенні келоїда, після впливу FOXO4-DRI поступово переміщується з ядра в цитоплазму: ядерне забарвлення помітно слабшало вже приблизно через дві доби обробки й майже повністю зникало до третьої доби (Kong та співавт., 2025).[6] Хоча задіяний сайт фосфорилювання відрізняється залежно від клітинного контексту, загальний принцип, ядерне виключення активованого p53 як передумова апоптозу, простежується в обох моделях.
Селективність дії пояснюється тим, що підвищена експресія FOXO4 сама по собі є відносно специфічною ознакою сенесценції: клітини з низьким базовим рівнем FOXO4 (проліферуючі, несенесцентні) зв’язують відносно мало пептиду і здебільшого залишаються неушкодженими. Це узгоджується з результатами, отриманими на хондроцитах з різною кількістю пасажів і на моделях келоїдних фібробластів (див. розділ «Дослідження in vitro та клітинні моделі»).
Дизайн і фізико-хімія
Абревіатура «DRI» позначає поєднання двох незалежних модифікацій відносно природного (усього-L) пептиду: «retro»: реверс порядку амінокислотних залишків відносно вихідної послідовності, і «inverso»: заміну кожного залишку на його D-стереоізомер. Застосовані одночасно до реверсованої послідовності, ці дві модифікації дають пептид, просторове розташування бічних ланцюгів якого приблизно відтворює топологію вихідного L-пептиду (і, відповідно, зберігає впізнавану цільовим білком геометрію поверхні зв’язування), тоді як сам пептидний кістяк тепер утворений амідними зв’язками D-конфігурації, які природні, L-специфічні протеази здебільшого не розпізнають як субстрат. Це надає пептиду істотну стійкість до протеолітичного розщеплення й, в принципі, довший функціональний час життя в біологічних рідинах порівняно з еквівалентним L-пептидом.
За структурними довідковими даними (реєстровий номер CAS (реєстраційний номер CAS) 2460055-10-9), FOXO4-DRI: пептид довжиною приблизно 47 залишків з молекулярною формулою C228H388N86O64 і молекулярною масою близько 5,36 кДа. Його послідовність поєднує короткий розпізнавальний фрагмент, похідний від форкхед-домену FOXO4 (описаний у розділі «Молекулярний механізм»), із катіонною, багатою на аргінін і лізин клітинно-проникною послідовністю, похідною від TAT-білка ВІЛ-1, поширений прийом для забезпечення клітинного й ядерного поглинання пептидів, які самі по собі не проникають крізь мембрану.
У дослідницькій практиці сполуку постачають у вигляді ліофілізованого порошку, який розчиняють безпосередньо перед використанням. В усіх цитованих тут дослідженнях на гризунах пептид вводили парентерально (внутрішньочеревно або внутрішньовенно) у дозі близько 5 мг/кг за переривчастою схемою: приблизно раз на одну-три доби, а не безперервно, що узгоджується із загальною логікою «hit-and-run»-дозування сенолітиків: короткого імпульсу препарату достатньо, щоб запустити елімінацію наявного пулу сенесцентних клітин, після чого ефект зберігається без постійної присутності речовини. У дослідженнях in vitro пептид додавали безпосередньо в культуральне середовище в концентраціях приблизно 25–50 мкМ (детальніше: у відповідному розділі).
Сам каркас DRI став відправною точкою для подальшої медико-хімічної оптимізації: Kang та співавт. (2025, Journal of Medicinal Chemistry)[8], спираючись на структурне розуміння інтерфейсу FOXO4-p53, розробили укорочену, оптимізовану за зарядом катіонну конструкцію з клітинно-проникним фрагментом (позначену як CPP-CAND), яка зберігає здатність руйнувати взаємодію FOXO4-p53 і вибірковість щодо сенесцентних клітин, водночас удосконалюючи окремі властивості вихідного дизайну DRI. Це ілюструє, що на сьогодні FOXO4-DRI функціонує в літературі і як самостійна сполука, і як перевірений механістичний еталон і структурна платформа для наступних розробок.
Доклінічні дослідження: in vivo
Уся наявна доказова база in vivo для FOXO4-DRI отримана виключно на гризунах; жодних даних на інших видах тварин чи будь-яких даних дозування за участю людей у рецензованій літературі немає.
| Дослідження | Модель | Доза / шлях / тривалість | Основні результати |
|---|---|---|---|
| Baar та співавт., 2017, Cell | Прогероїдні миші Xpd(TTD/TTD) (дефіцит ексцизійної репарації нуклеотидів, пришвидшене старіння) та природно старі миші (лінія-репортер p16-3MR, ~104 тижні) | 3 внутрішньовенні ін’єкції по 5 мг/кг через день | Відновлення густоти хутра, рухової активності й реакції на подразники; зниження рівня сечовини та креатиніну плазми (покращення ниркової функції) в обох моделях |
| Baar та співавт., 2017, Cell (модель хіміотоксичності) | Ті самі мишачі лінії, індукція доксорубіцином | 2 внутрішньочеревні ін’єкції доксорубіцину по 10 мг/кг з інтервалом в добу, потім FOXO4-DRI на 1-шу, 3-тю та 5-ту добу | Пептид пом’якшив ознаки доксорубіцин-індукованої хіміотоксичності (нижчі маркери ураження печінки, краща переносимість), одна з перших демонстрацій, що пептидне усунення сенесцентних клітин захищає тканини від хіміотерапевтичного ушкодження |
| Zhang та співавт., 2020, Aging | Природно старі самці мишей C57BL/6 (20–24 міс.) проти молодих контролів (3 міс.) | Внутрішньочеревно 5 мг/кг через день, 3 введення; оцінка результатів приблизно через 30 діб | Значуще підвищення сироваткового тестостерону; зниження маркерів сенесценції клітин Лейдіга (SA-β-gal, білки p53/p21/p16); зростання стероїдогенних ферментів 3β-HSD і CYP11A1; зниження прозапальних цитокінів SASP (IL-1β, IL-6, TGF-β); маса тіла й сім’яників без значущих змін[4] |
| Hu та співавт., 2026, Frontiers in Bioengineering and Biotechnology | Природно старі миші (17 міс.) та миші з пришвидшеним старінням, індукованим D-галактозою | Внутрішньочеревно 5 мг/кг раз на 2 доби: 1 місяць (природне старіння) або 4 тижні після попередніх 4 тижнів введення D-галактози (індукована модель) | Зниження швидкості поширення пульсової хвилі (краща еластичність судин), зменшення товщини стінки аорти; зниження маркерів сенесценції (p16, p21, SA-β-gal); підвищення проліферативного маркера Ki-67; зниження рівня активних форм кисню та прозапальних цитокінів у судинній тканині |
В усіх наведених роботах ефекти отримані виключно за переривчастого парентерального введення гризунам; жодне з досліджень не встановлює еквівалентну дозу для людини, а безпосередня екстраполяція результатів на людський організм наразі не підтверджена.
Дослідження in vitro та клітинні моделі
Дослідження на культурах клітин людини та тканинних експлантах поширюють описаний механізм на кілька різних клітинних систем, однак так само не встановлюють жодного режиму дозування, придатного для людини.
| Дослідження | Клітинна / тканинна модель | Концентрація / тривалість | Основні результати |
|---|---|---|---|
| Huang та співавт., 2021, Frontiers in Bioengineering and Biotechnology | Хондроцити суглобового хряща людини (8 донорів); сенесцентна популяція: розширена культура (PDL9) проти малопасажних, несенесцентних клітин (PDL3) | 25 мкМ, 5 діб у середовищі з 2% FBS, далі 2–3 доби відновлення в ростовому середовищі | Пептид усунув через апоптоз понад половину клітин популяції PDL9; частка SA-β-gal-позитивних клітин різко скоротилася; білкові рівні p16, p21 і p53 знизилися. На малопасажні, несенесцентні клітини PDL3 суттєвого впливу не мало: пряме підтвердження селективності дії[5] |
| Kong та співавт., 2025, Communications Biology | Фібробласти келоїдної тканини людини та органні експланти келоїда (циліндри діаметром 4 мм, отримані трепаном) | 25 мкМ, 3 доби (фібробласти); експланти підтримували в культурі до 10 діб | Вихідна частка келоїдних фібробластів у стані арешту G0/G1 була помітно вищою, ніж у нормальних фібробластах; після обробки пептидом ця частка суттєво зменшилась в обох групах. TUNEL-позитивні (апоптотичні) клітини з’являлися вже після 3 діб обробки, їх кількість починала знижуватися з 7-ї доби і майже зникала до 10-ї. Ядерне забарвлення p53-pS15 слабшало вже приблизно через 48 годин і майже повністю переміщувалося в цитоплазму до 72 годин |
| Hu та співавт., 2026 (компонент in vitro), Frontiers in Bioengineering and Biotechnology | Ендотеліальні клітини пупкової вени людини (HUVEC); сенесцентність індукована депривацією кисню й глюкози (OGD) | 50 мкМ, 3 години (одночасно з OGD-впливом) | Зниження частки SA-β-gal-позитивних клітин, білків p16 і p21; зростання проліферативного маркера Ki-67; зниження маркера ушкодження ДНК γ-H2AX; зниження рівня активних форм кисню (за DHE-забарвленням) і прозапальних цитокінів SASP (IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α). На молекулярному рівні: зменшення зв’язування FOXO4-p53, зростання фосфорильованого за серином-46 p53 та його виходу з ядра, зростання BAX і активної каспази-3, зниження BCL2 |
Спільним для всіх трьох моделей є те, що апоптоз і «прибирання» клітин обмежені саме сенесцентною субпопуляцією, тоді як проліферуючі чи мінімально пасажовані клітини залишаються практично не порушеними. Це узгоджується з механізмом селективності, описаним вище. Окремим напрямом досліджень in vitro стало картування «гарячих точок» зв’язування FOXO4-p53 (Zhang R. та співавт., 2023) та розробка на його основі оптимізованих похідних конструкцій, зокрема CPP-CAND (Kang та співавт., 2025), яку тестували на моделях сенесцентних пухлинних клітин. Це поширює валідацію механізму DRI-класу пептидів за межі «класичних» моделей сенесценції також на онкологічний контекст.
Дослідження за участю людей і клінічні дані
Затвердженої дози FOXO4-DRI для людини не існує, і жодного завершеного контрольованого клінічного дослідження цієї сполуки за участю людей у рецензованій літературі не опубліковано. Усі наведені вище дані ефективності отримані або на гризунах in vivo, або на клітинах чи тканинах людини, досліджених поза організмом (in vitro, у складі органних експлантів), але не шляхом введення речовини живим людям.
Для цього класу пептидів характерні типові трансляційні бар’єри. Великий, сильно заряджений, неприродний D-пептид не має пероральної біодоступності й потребує парентерального введення. Формальні токсикологічні дослідження, необхідні для дозволу на клінічні випробування, оцінка імуногенності (D-пептиди, попри стійкість до протеаз, за повторного введення теоретично залишаються потенційним антигеном) і фармакокінетична характеристика в людини для FOXO4-DRI не публікувалися. Для порівняння: споріднені сенолітики на основі малих молекул, як-от комбінація дазатинібу та кверцетину, вже мали історію застосування та профіль безпеки за іншими показаннями, що дозволило їм швидше дійти до невеликих пілотних досліджень за участю людей, ніж це можливо для абсолютно нового синтетичного пептиду.
Заяви про дозування, «курси» чи «протоколи проти старіння» для FOXO4-DRI, що циркулюють поза межами рецензованої наукової літератури (маркетингові матеріали постачальників дослідницьких пептидів, форуми біохакерів), не підкріплені жодними опублікованими даними за участю людей і виходять за межі цього довідкового матеріалу. Цей розділ і стаття загалом документують саме доклінічні (тваринні та людські клітинні/тканинні) дослідницькі результати.
Фармакокінетика та стабільність
Жодних фармакокінетичних параметрів для людини (Cmax, Tmax, період напіввиведення, кліренс, об’єм розподілу) для FOXO4-DRI не встановлено й не опубліковано. Усі наявні відомості мають опосередкований характер і випливають зі схем дозування, використаних у дослідженнях ефективності на гризунах: у кожному з них тварин повторно вводили препарат кожні одну-три доби, а не одноразово, схема, більш притаманна речовині з відносно коротким функціональним часом дії в організмі, ніж довготривало циркулюючому біологічному препарату. Утім, це не підтверджено прямим послідовним вимірюванням концентрації в крові в жодному з опублікованих досліджень FOXO4-DRI.
Механістично, D-ретро-інверсо кістяк пептиду має бути стійким до розщеплення природними, L-специфічними екзо- та ендопептидазами. Це і є основне обґрунтування вибору саме DRI-архітектури замість стандартного L-пептида (див. розділ «Дизайн і фізико-хімія»). Однак стійкість до протеаз усуває лише один шлях деградації. Інші вразливості, типові для катіонних, багатих на аргінін і лізин пептидів такого розміру, залишаються актуальними в принципі: неферментативні шляхи деградації (окиснення чутливих залишків, дезамідування) та схильність до самоагрегації у водному розчині за вищих концентрацій через сильний сумарний позитивний заряд молекули. Саме тому холодне зберігання та мінімізація циклів заморожування-розморожування є стандартними рекомендаціями для роботи з пептидами цього класу (див. розділ «Аналітична характеризація та поводження»).
Даних щодо пероральної біодоступності немає, і їх апріорі не очікується, зважаючи на розмір і заряд молекули: у всіх опублікованих дослідженнях in vivo використовували виключно парентеральне (внутрішньочеревне або внутрішньовенне) введення. Специфічних для FOXO4-DRI даних про тканинний розподіл, ідентифікацію метаболітів чи шляхи ниркового/печінкового кліренсу в літературі не публікували.
Аналітична характеризація та поводження
Дослідницький FOXO4-DRI характеризують стандартними методами контролю якості пептидів: зворотно-фазовою високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ): для оцінки чистоти за площею інтегрованого піку, та мас-спектрометрією (зазвичай ESI або MALDI-TOF): для підтвердження ідентичності шляхом порівняння спостережуваної маси з очікуваною молекулярною масою (близько 5,36 кДа, що узгоджується з формулою C228H388N86O64, наведеною в розділі «Дизайн і фізико-хімія»). Оскільки сполука визначається саме через свій усього-D-амінокислотний склад, підтвердження стереохімічної ідентичності (того, що матеріал справді складається з D-, а не L-залишків) в принципі потребує хіральних аналітичних методів, наприклад, хіральної ВЕРХ або аналізу амінокислотного складу після кислотного гідролізу, оскільки D- і L-пептиди з ідентичною послідовністю невідрізнювані за самою лише масою.
Поводження й зберігання відповідають конвенціям, типовим для катіонних, схильних до агрегації дослідницьких пептидів. Матеріал постачають ліофілізованим і зберігають замороженим, захищеним від світла й вологи, до моменту розчинення. Після розчинення (зазвичай у бактеріостатичній або стерильній лабораторній воді) розчин рекомендується розділити на аліквоти, зберігати охолодженим і використовувати якнайшвидше, оскільки пептид у розчині значно більш вразливий до гідролізу та агрегації, ніж сухий ліофілізат; повторних циклів заморожування-розморожування слід уникати, оскільки вони посилюють як деградацію, так і утворення агрегатів.
Додаткові параметри якості, актуальні саме для матеріалу, призначеного для роботи з живими клітинними культурами, тести на стерильність та вміст ендотоксину (наприклад, LAL-тест), а також партійні сертифікати аналізу зазвичай надаються постачальниками окремо від рецензованої наукової літератури, і їх варто перевіряти для кожної конкретної партії реагенту перед використанням у чутливих аналізах.
Дослідницьке застосування
У лабораторній практиці FOXO4-DRI використовують як механістично добре охарактеризований «еталонний» сенолітичний реагент: для перевірки причинного внеску сенесцентних клітин у той чи інший експериментальний фенотип, а дедалі частіше й як структурну відправну точку для розробки вдосконалених руйнівників взаємодії FOXO4-p53. У цитованій тут літературі задокументовано, зокрема, такі напрями застосування:
- дослідження хіміотерапевтично-індукованої сенесценції та пов’язаного з нею пошкодження тканин (модель хіміотоксичності доксорубіцину);
- репродуктивне й ендокринне старіння: роль сенесцентних клітин Лейдіга у віковому дефіциті тестостерону;[11]
- клітинна біологія хряща й регенеративна інженерія: усунення сенесцентних клітин з експандованих у культурі хондроцитів, які розглядають як матеріал для клітинної терапії хряща;
- патобіологія фіброзу й патологічного рубцювання: роль сенесцентних фібробластів у персистенції келоїдної тканини;[10]
- судинне старіння: вплив ендотеліальної та судинної сенесценції на еластичність і функцію судин;
- медико-хімічний скринінг і оптимізація: FOXO4-DRI як референсна структура для картування «гарячих точок» взаємодії FOXO4-p53 і розробки наступного покоління пептидних інгібіторів цієї взаємодії;
- референсний/контрольний сенолітик під час розробки аналітичних панелей маркерів сенесценції та для порівняльного бенчмаркінгу нових сенолітичних кандидатів.
У всіх цих контекстах FOXO4-DRI застосовують виключно як лабораторний дослідницький реагент (RUO). Сполука не має встановленого терапевтичного показання і не призначена для введення людині чи тварині поза межами контрольованого дослідницького експерименту.