IGF-1 LR3 (Long R3 IGF-1), рекомбинантный аналог человеческого инсулиноподобного фактора роста 1 длиной 83 аминокислоты. Это один из самых плохо понятых реагентов в каталоге исследовательских пептидов: вокруг названия наросло изрядно зального фольклора, тогда как сама молекула, хорошо охарактеризованный лабораторный инструмент с конкретным задокументированным происхождением, конкретным задокументированным назначением и конкретным задокументированным риском. Ниже, две структурные модификации, определяющие эту молекулу, почему они значат больше, чем кажется на первый взгляд, как она передаёт сигнал, что на ней реально изучали и где заканчиваются данные.

Всё изложенное, справочный материал, пересказывающий опубликованные исследования на клетках и животных. IGF-1 LR3 поставляется исключительно как лабораторный исследовательский реагент: не для потребления человеком, не для диагностического или терапевтического применения. Одобренного показания для человека не существует, и ничто здесь не является протоколом.

Отправная точка: нативный IGF-1 и проблема IGFBP

Нативный человеческий IGF-1, одноцепочечный полипептид из 70 аминокислот, структурно родственный проинсулину, главный посредник анаболического действия гормона роста. Действует преимущественно через рецептор IGF 1-го типа (IGF-1R), рецепторную тирозинкиназу.

Ключевая деталь, которая и объясняет, зачем вообще существует IGF-1 LR3: в кровотоке IGF-1 почти никогда не бывает свободным. Подавляющая его часть захвачена семейством из шести высокоаффинных IGF-связывающих белков (IGFBP-1, IGFBP-6), прежде всего IGFBP-3, который несёт IGF-1 в тернарном комплексе с кислотолабильной субъединицей [3]. Эти белки, не пассивные переносчики. Они работают как циркулирующий резервуар, удлиняют время пребывания пептида в плазме и, что важнее всего для экспериментатора, секвестрируют лиганд, ограничивая его доступ к рецептору [3][4].

Для исследователя это создаёт практическую проблему. Добавьте нативный IGF-1 в культуру с сывороткой или введите его животному, и значительная, к тому же переменная, доля внесённого будет немедленно перехвачена уже присутствующими там IGFBP. Эффективная, доступная рецептору концентрация оказывается и существенно ниже номинальной, и плохо управляемой. Собственная регуляторная машинерия системы IGF прямо работает против воспроизводимости эксперимента.

Что такое IGF-1 LR3: две модификации в одной молекуле

IGF-1 LR3, это нативный IGF-1 с двумя независимыми модификациями, каждую из которых проработали отдельно, прежде чем объединить. Обе существуют ради одной цели: оторвать пептид от связывающих белков.

1. Замена Glu3 → Arg, та самая «R3»

В 1988 году Bayne с соавторами (Merck) получили систематическую серию структурных аналогов человеческого IGF-1, чтобы выяснить, какие участки молекулы отвечают за связывание с сывороточными связывающими белками, а какие, за связывание с рецепторами. Решающим оказался N-концевой участок: изменённые там аналоги показали заметно сниженное сродство к сывороточным связывающим белкам и к рецептору IGF 2-го типа, сохранив при этом связывание с IGF-1R [1]. Замену глутамата в позиции 3 на аргинин, отсюда «R3», ввёл позже, в 1992 году, Francis с соавторами; именно она дошла до реагента, которым пользуются сегодня [2].

2. N-концевое удлинение на 13 остатков, та самая «Long»

Вторая модификация добавляет к N-концу удлиняющий пептид из 13 аминокислот (MFPAMPLSSLFVN). Его происхождение отчасти сугубо практическое: удлинение происходит из рекомбинантной системы экспрессии слитого белка, которой аналог нарабатывают в бактериях, и оно улучшает экспрессию и выход. Но это не просто производственный артефакт, оставленный для удобства,, оно дополнительно ослабляет ассоциацию с IGFBP, усиливая эффект замены Arg3 [2].

70 нативных остатков плюс 13 остатков удлинения и дают ту 83-аминокислотную цепь, которая определяет молекулу. Обратите внимание: «R3» в названии указывает на позицию 3 нативной последовательности IGF-1, а не на позицию 3 в 83-остаточной конструкции, мелочь, которая стабильно сбивает с толку тех, кто пытается найти замену, просто отсчитав третий остаток полной последовательности.

Что дало сочетание

Francis с соавторами охарактеризовали эти рекомбинантные аналоги слитых белков в 1992 году и сравнили их напрямую. Их вывод стоит сформулировать точно, поскольку он и есть полное обоснование молекулы: повышенная биологическая потентность этих аналогов обусловлена главным образом их сниженным сродством к IGF-связывающим белкам, а не каким-либо улучшением связывания с рецептором [2]. LR3 IGF-1 не связывается с IGF-1R лучше нативного IGF-1, на деле его рецепторное сродство даже несколько ниже. Он потентнее в биологических системах именно потому, что несравнимо большая его доля остаётся свободной и способной добраться до рецептора.

Почему уход от IGFBP меняет фармакологию

Следствие, большое смещение свободной фракции. В любой системе, где присутствуют IGFBP (культуральная среда с сывороткой или живой организм), LR3 IGF-1 ведёт себя так, будто внесли значительно более высокую концентрацию нативного IGF-1, потому что буферная стадия, обычно поглощающая большую часть внесённого, почти не срабатывает.

Самую чёткую количественную оценку дали Tomas с соавторами: они вводили IGF-1 и LR3 IGF-1 растущим самкам крыс в течение 14 дней через подкожно имплантированные осмотические помпы. Оба пептида дозозависимо повышали прирост массы тела, азотистый баланс и эффективность конверсии корма. LR3 IGF-1 оказался заметно потентнее: примерно 44 мкг/сут варианта давали эффекты, сопоставимые с 278 мкг/сут нативного IGF-1, разница в потентности приблизительно шестикратная [8]. Итог авторов относительно механизма точно совпадает с замыслом конструкции: варианты IGF-1, которые хуже связываются с IGF-связывающими белками, активнее самого IGF-1. Эти цифры описывают то, что инфузировали крысам в том исследовании; они не являются и не могут быть пересчитаны в дозу для чего-либо иного.

Утверждение о периоде полувыведения, которое не выдерживает проверки

Широко тиражируется тезис, что IGF-1 LR3 обладает резко удлинённым периодом полувыведения, свободно ходят цифры в диапазоне 20–30 часов, и якобы именно потому, что он уходит от связывающих белков. Это переворачивает фармакологию с ног на голову, и об этом стоит сказать прямо.

Связывание с IGFBP, это как раз то, что удлиняет пребывание IGF-1 в плазме; связанный пул является резервуаром, который защищает пептид от клиренса. Уберите связывание, уберёте и резервуар. Соответствующее измерение принадлежит Ballard с соавторами, которые сравнили плазменный клиренс меченого IGF-1, IGF-2 и des(1-3)IGF-1 у крыс. des(1-3)IGF-1, разделяющий с LR3 определяющее свойство очень слабого связывания с IGFBP, выводился заметно быстрее интактного IGF-1: средний общий плазменный клиренс 4,59 против 1,20 мл/мин на кг, то есть почти четырёхкратная разница; большая часть радиоактивности des(1-3)IGF-1 оставалась свободной, а не связанной с белками [5].

Это измерено на des(1-3)IGF-1, а не на LR3 IGF-1, так что перед нами вывод по аналогии, а не прямое измерение, и мы это честно обозначаем. Но направление механистически понятно, а расходящиеся «длинные» цифры полувыведения для LR3 не сводятся ни к одному чистому первичному источнику. Более высокая потентность в литературе о LR3 происходит от большей свободной фракции, а не от длительности пребывания.

IGF-1 LR3 против нативного IGF-1 и против des(1-3)IGF-1

Эти три постоянно путают. Это разные молекулы с разным поведением:

  • Нативный IGF-1, 70 остатков, без модификаций. Связывается с IGFBP с высоким сродством, поэтому большая его часть секвестрирована; долгое пребывание в плазме в составе связанного пула, малая свободная фракция, а фактическая активность сильно зависит от профиля IGFBP той системы, в которой он оказался.
  • des(1-3)IGF-1, укороченный аналог, 67 остатков, полученный удалением N-концевого трипептида Gly-Pro-Glu. Слабого связывания с IGFBP достигает вычитанием. Сохраняет сродство к IGF-1R, потентнее нативного IGF-1 в системах с IGFBP и быстрее выводится из плазмы [5].
  • IGF-1 LR3, удлинённый и замещённый аналог, 83 остатка. Слабого связывания с IGFBP достигает двумя совмещёнными модификациями, а не укорочением, и N-концевое удлинение дополнительно подходит рекомбинантному производству [2].

Общее здесь то, что des(1-3)IGF-1 и LR3 IGF-1, два разных инженерных пути к одной цели: получить IGF-1, который связывающие белки по большей части игнорируют. Оба разработали пересекающиеся по составу группы в одну эпоху и по одной и той же экспериментальной причине.

Сигналинг: IGF-1R, PI3K/Akt и MAPK

Оказавшись свободным, IGF-1 LR3 делает то же, что и IGF-1: задействует IGF-1R. Связывание лиганда активирует собственную тирозинкиназу рецептора, которая автофосфорилируется и рекрутирует адаптерные белки семейства IRS и Shc. Дальше сигнал расходится на два главных плеча [6]:

  • IRS → PI3K → Akt, метаболическое плечо и плечо выживания клетки, тянущееся дальше к mTOR, GSK3 и транскрипционным факторам FoxO. Эта ветвь управляет синтезом белка, захватом глюкозы и подавлением апоптоза.
  • Shc → Ras → Raf → MEK → ERK (MAPK), митогенное плечо, связанное с пролиферацией и изменениями экспрессии генов, ведущими к входу в клеточный цикл.

Какое плечо доминирует, зависит от типа клеток и контекста, и это различие не академическое. В культивируемых скелетных миотубах Rommel с соавторами показали, что индуцированная IGF-1 гипертрофия опосредована именно сигналингом PI3K/Akt/mTOR и PI3K/Akt/GSK3 [7], гипертрофический считываемый показатель идёт за Akt-ветвью. Сигналинг IGF-1R также перекрёстно взаимодействует с сигналингом инсулинового рецептора, что неизбежно ввиду близкой гомологии этих рецепторов, а при достаточной концентрации аналоги IGF-1 способны задействовать и инсулиновые рецепторы, это важный фон для метаболических эффектов, описанных в литературе об IGF.

Для чего IGF-1 LR3 используют на самом деле

Клеточная культура, наиболее задокументированное применение

Лучше всего задокументированное реальное применение Long R3 IGF-1 невзрачно и к животным отношения не имеет: это добавка к клеточным культурам, более потентный и стабильный заменитель инсулина в бессывороточных промышленных культурах. Morris и Schmid изучали именно это, показав влияние инсулина и LongR3 на бессывороточные культуры клеток яичника китайского хомячка (CHO), экспрессирующих два рекомбинантных белка [9]. Поскольку в бессывороточных средах нет IGFBP, которые иначе секвестрировали бы фактор роста, а LR3 активен в значительно более низких концентрациях, чем инсулин, он поддерживает пролиферацию и продуктивность в биореакторной культуре. Это и есть то применение, под которое молекулу фактически продуктизировали, и в этой роли она, действительно полезный исследовательский реагент.

Модели пролиферации, гипертрофии и метаболизма

Вне культуры LR3 IGF-1 фигурирует в доклинической литературе как инструмент для изучения оси IGF там, где вмешательство IGFBP исказило бы считываемый показатель: анаболические исследования и исследования азотистого баланса на грызунах [8], а также модели, изучающие IGF-1R-зависимую пролиферацию и рост. Ценность аналога в этих условиях методологическая: он отделяет эффекты уровня рецептора от эффектов связывающих белков, чего нативный IGF-1 сделать не может.

Пролиферация и онкологическая настороженность

Это тот раздел, который определяет, к какой категории относится молекула, и он не является оговоркой, приклеенной в конце,, он прямо вытекает из описанного выше механизма.

Сигналинг IGF-1R является митогенным и антиапоптотическим. Это не побочные эффекты; это путь, работающий как задумано. Те же плечи PI3K/Akt и Ras/MAPK, которые запускают синтез белка и выживание клетки, принадлежат к наиболее тщательно задокументированным протуморогенным сигнальным маршрутам в онкобиологии. Обзор Pollak об инсулиновом и IGF-сигналинге в неоплазии излагает это подробно: активация IGF-1R поддерживает пролиферацию, защищает трансформированные клетки от апоптоза и способствует прогрессированию опухоли, и именно поэтому IGF-1R разрабатывали как онкологическую мишень: терапевтический интерес состоит в том, чтобы этот рецептор блокировать, а не стимулировать [10].

Эпидемиология указывает в ту же сторону. Систематический обзор и метарегрессионный анализ Renehan с соавторами обнаружили, что более высокие концентрации циркулирующего IGF-1 ассоциировались с повышенным риском определённых раков, в том числе простаты и пременопаузального рака груди [11]. Это ассоциация в обсервационных данных в пределах физиологического диапазона, и причинности она не устанавливает, но честное прочтение таково: она согласуется с механистической настороженностью, а не опровергает её.

Теперь соедините два факта. IGF-1 LR3 сконструирован именно для того, чтобы преодолеть главный механизм, которым организм контролирует, сколько свободного IGF-1 добирается до рецептора, и он примерно вшестеро потентнее нативного IGF-1 in vivo [8]. Система IGFBP, которую он обходит,, это регуляторный тормоз. Соединение, вся конструкторская предпосылка которого состоит в длительной, небуферизованной стимуляции хорошо описанного пролиферативного и антиапоптотического рецептора,, это соединение с неоценённым количественно пролиферативным риском, включая возможность способствовать росту уже имеющихся, невыявленных неопластических клеток. Ни одно исследование не охарактеризовало этот риск у людей, потому что соответствующее исследование не проводили и не одобрили бы.

Это и есть конкретная причина, почему IGF-1 LR3, исследовательский реагент и ничего больше. Не регуляторная формальность и не юридическая условность. Это корректная классификация с учётом того, что молекула делает.

Пределы доказательной базы

Честный перечень того, чего здесь не знают, длиннее, чем признаёт большинство источников:

  • Доказательная база, преимущественно грызуны и клеточные культуры. Формообразующие in vivo данные по LR3 IGF-1, это крысиные исследования начала 1990-х [8] с малыми по современным меркам группами. Физиология IGF и IGFBP у грызунов не тождественна человеческой.
  • Контролируемых исследований IGF-1 LR3 на людях нет. Не «мало», ни одного значимого. Любое утверждение о его поведении в теле человека является межвидовой экстраполяцией из нескольких экспериментов на животных.
  • Одобренного показания не существует нигде. Рекомбинантный нативный IGF-1 (мекасермин) имеет узкое одобренное применение при тяжёлом первичном дефиците IGF-1; это одобрение ничего не говорит о LR3, другой молекуле с намеренно иным поведением связывания.
  • Фармакокинетика охарактеризована плохо. Как показано выше, тиражируемые цифры полувыведения не имеют чистого первичного источника, а ближайшее прямое измерение сделано на родственном, но отличном аналоге [5].
  • Данных по длительной безопасности нет ни у одного вида при какой-либо экспозиции, релевантной фольклору,, а описанная выше пролиферативная настороженность является именно тем типом риска, который могут закрыть только долгосрочные данные.
  • Идентичность и чистота реагента, переменные величины. 83-остаточный рекомбинантный пептид может быть ложно идентифицированным, укороченным или просто чем-то иным; без аналитической характеризации конкретной партии опубликованная литература не обязательно описывает то, что находится во флаконе.

Обращение и характеризация

IGF-1 LR3 поставляется в виде лиофилизированного порошка, именно так стабилизируют пептиды такого размера для хранения и транспортировки. Как рекомбинантный белок он конформационно уязвимее короткого синтетического пептида: чувствителен к нагреву, к повторным циклам замораживания-размораживания и к интенсивному встряхиванию, каждое из которых способно денатурировать или агрегировать его и незаметно отнять активность без каких-либо видимых изменений. Для работы in vitro такой материал восстанавливают в стерильной воде, PBS или разведённой уксусной кислоте, в зависимости от условий эксперимента; бактериостатическая вода является растворителем для многодозовых инъекционных препаратов для человека, а не лабораторным стандартом. Общие принципы восстановления лиофилизированного материала разобраны в нашей монографии о бактериостатической воде.

Поскольку идентичность и чистота для этого класса, как отмечено, являются переменными, аналитика уровня партии значит больше этикетки. На странице продукта IGF-1 LR3 приведены спецификация и партийный сертификат анализа на материал, который мы держим на складе,, чтобы идентичность и чистоту конкретного лота можно было проверить, а не предполагать.

Только для исследовательского использования

Эта статья составлена из публично доступной рецензируемой литературы и предоставляется исключительно в справочных и информационных целях. Это не медицинский совет и не рекомендация по применению. IGF-1 LR3, экспериментальное соединение, не являющееся одобренным лекарственным средством ни в одной юрисдикции. Продукты, упомянутые здесь, поставляются строго только для лабораторных исследовательских целей: они не предназначены для потребления человеком, ни для диагностического или терапевтического применения. Все количества и результаты, описанные выше, получены в контролируемых экспериментальных условиях на клетках или животных и не могут толковаться как инструкция.

Полный перечень источников со ссылками, в монографии: IGF-1 LR3.