Флакон с исследовательским пептидом проходит долгий путь, прежде чем попасть на анализ. Молекулу сначала собирают химически, звено за звеном, а затем отделяют от побочных продуктов этого же синтеза. Оба шага определяют, что именно увидит лаборатория, когда будет измерять чистоту готовой партии.

Синтез: как из аминокислот собирают цепь

Пептид, это цепь аминокислот, соединённых пептидными связями. Способ собрать такую цепь в промышленных масштабах называют твердофазным пептидным синтезом, или SPPS (solid-phase peptide synthesis). Метод описал Роберт Брюс Меррифилд в 1963 году на примере синтеза тетрапептида [1], и именно за него он позже получил Нобелевскую премию по химии.

Принцип простой, хотя исполнение нет. Первую аминокислоту химически закрепляют на нерастворимой смоле. Далее к ней по очереди присоединяют следующие аминокислоты, одну за другой, в заданной последовательности. Перед каждым присоединением боковую группу новой аминокислоты и уже собранной цепи защищают временными химическими группами, чтобы реакция шла точно там, где нужно. Самая распространённая сегодня схема защиты называется Fmoc; она вытеснила более старую Boc-схему благодаря более мягким условиям снятия защиты [2]. Когда все звенья на месте, готовую цепь отщепляют от смолы и освобождают боковые группы от защитных.

Поскольку цепь собирают по одному звену, каждый отдельный шаг присоединения имеет собственную эффективность: обычно высокую, но не стопроцентную. Для короткого пептида из нескольких звеньев это почти незаметно. Для более длинной цепи погрешность каждого шага накапливается, и на выходе реактора оказывается не одна чистая молекула, а смесь. Преимущественно это целевой пептид, а рядом с ним, молекулы с пропущенным звеном, с неснятой защитой или с побочной реакцией на одном из шагов.

Почему "сырой" пептид ещё не готов к анализу

Смесь, которую снимают со смолы сразу после синтеза, в отрасли называют сырым пептидом (crude peptide). В ней, кроме целевой молекулы, есть укороченные последовательности (их ещё называют делеционными пептидами), остатки не до конца снятых защитных групп и соединения из побочных реакций во время сборки цепи. Большинство этих примесей по структуре очень близки к целевому пептиду: это та же последовательность аминокислот, только с одним-двумя отсутствующими или заменёнными звеньями.

К массе сырого материала добавляется ещё кое-что, что самим пептидом не является: противоион, остающийся от химии синтеза. Чаще всего это трифторуксусная кислота (TFA) или ацетат, и поэтому нетто-содержание целевого пептида в готовом флаконе почти всегда ниже общей навески порошка. Обзор примесей в пептидных препаратах классифицирует эти побочные соединения по происхождению и показывает, почему их нельзя убрать простым более аккуратным повторением синтеза: часть примесей химически слишком близка к целевой молекуле и требует отдельного физического разделения уже после завершения реакции [3].

Очистка: как отделяют целевую молекулу от примесей

Разделение выполняют препаративной жидкостной хроматографией с обращённой фазой, тем же физическим принципом, который позже применит аналитическая HPLC для измерения чистоты, только в масштабе, рассчитанном на реальное количество материала, а не на микролитровую пробу. Смесь пропускают через колонку с гидрофобным сорбентом и вымывают градиентом растворителя нарастающей концентрации. Молекулы удерживаются на сорбенте по-разному в зависимости от собственной гидрофобности, поэтому целевой пептид и ближайшие к нему по структуре примеси выходят из колонки в чуть разное время.

Классическая работа по препаративной хроматографии пептидов с обращённой фазой ещё в 1984 году показала, что метод масштабируется от микрограммовых до многограммовых загрузок без существенной потери разделительной способности [4]. Именно это свойство сделало его отраслевым стандартом для синтетических пептидов, а не лабораторной диковинкой. Фракции, выходящие из колонки, собирают отдельно и проверяют: дальше, к анализу, идёт только та часть, где преобладает целевой пик.

Разделение близкородственных примесей никогда не бывает идеальным за одну хроматографическую процедуру. Поэтому очищенный материал всё равно требует измерения: сколько целевого вещества осталось после разделения и не попало ли туда что-то постороннее. Ответ на это даёт уже не препаративная, а аналитическая часть процесса.

Что дальше

Синтез и очистка отвечают на вопрос «как сделать пептид», а не на вопрос «что именно получилось». На второй отвечают аналитическая HPLC и масс-спектрометрия: первая измеряет долю целевого пика среди остальных, вторая подтверждает, что измеренная масса соответствует расчётной для заданной последовательности. Оба метода подробно разобраны в гиде по чтению COA пептида. Результаты этих измерений лаборатория оформляет как документ на конкретную партию, а что именно такой документ подтверждает и чего не подтверждает, рассказано в материале о том, что доказывает сертификат анализа.

Коротко о строении пептида, классах молекул и всём пути от синтеза до сертификата рассказано на странице «Что такое пептиды» бренда Tripept.

Каталог и проверка

Смотрите каталог исследовательских пептидов. Партии сопровождаются сертификатами анализа от независимых сторонних лабораторий, опубликованными в открытом архиве COA.

Материал носит справочный характер, описывает процесс производства исследовательского реактива и не является инструкцией по применению.

Источники

  1. Merrifield RB. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society, 1963. https://doi.org/10.1021/ja00897a025
  2. Behrendt R, White P, Offer J. Advances in Fmoc solid-phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science, 2016. https://doi.org/10.1002/psc.2836
  3. D'Hondt M, Bracke N, Taevernier L, et al. Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2014.06.012
  4. Rivier J, McClintock R, Galyean R, Anderson H. Reversed-phase high-performance liquid chromatography: preparative purification of synthetic peptides. Journal of Chromatography A, 1984. https://doi.org/10.1016/S0021-9673(01)93709-4