Флакон із дослідницьким пептидом проходить довгий шлях, перш ніж потрапити на аналіз. Молекулу спочатку збирають хімічно, ланка за ланкою, а тоді відділяють від побічних продуктів цього самого синтезу. Обидва кроки визначають, що саме побачить лабораторія, коли вимірюватиме чистоту готової партії.

Синтез: як з амінокислот збирають ланцюг

Пептид, це ланцюг амінокислот, з'єднаних пептидними зв'язками. Спосіб зібрати такий ланцюг у промислових масштабах називають твердофазним пептидним синтезом, або SPPS (solid-phase peptide synthesis). Метод описав Роберт Брюс Мерріфілд 1963 року на прикладі синтезу тетрапептиду [1], і саме за нього він згодом отримав Нобелівську премію з хімії.

Принцип простий, хоча виконання ні. Першу амінокислоту хімічно закріплюють на нерозчинній смолі. Далі до неї по черзі приєднують наступні амінокислоти, одну за одною, у заданій послідовності. Перед кожним приєднанням бічну групу нової амінокислоти й уже зібраного ланцюга захищають тимчасовими хімічними групами, щоб реакція йшла точно там, де потрібно. Найпоширеніша сьогодні схема захисту зветься Fmoc; вона витіснила старшу Boc-схему завдяки м'якішим умовам зняття захисту [2]. Коли всі ланки на місці, готовий ланцюг відщеплюють від смоли й звільняють бічні групи від захисних груп.

Оскільки ланцюг збирають по одній ланці, кожен окремий крок приєднання має власну ефективність: зазвичай високу, але не стовідсоткову. Для короткого пептиду з кількох ланок це майже непомітно. Для довшого ланцюга похибка кожного кроку накопичується, і на виході реактора опиняється не одна чиста молекула, а суміш. Переважно це цільовий пептид, а поряд з ним, молекули з пропущеною ланкою, з незнятим захистом або з побічною реакцією на одному з кроків.

Чому "сирий" пептид ще не готовий до аналізу

Суміш, яку знімають зі смоли одразу після синтезу, у галузі називають сирим пептидом (crude peptide). У ній, крім цільової молекули, є вкорочені послідовності (їх ще звуть делеційними пептидами), залишки не до кінця знятих захисних груп і сполуки з побічних реакцій під час збирання ланцюга. Більшість цих домішок за структурою дуже близькі до цільового пептиду: це та сама послідовність амінокислот, тільки з однією-двома відсутніми чи заміненими ланками.

До маси сирого матеріалу додається ще дещо, що самим пептидом не є: протиіон, який лишається від хімії синтезу. Найчастіше це трифтороцтова кислота (TFA) або ацетат, і тому нетто-вміст цільового пептиду в готовому флаконі майже завжди нижчий за загальну наважку порошку. Огляд домішок у пептидних препаратах класифікує ці побічні сполуки за походженням і показує, чому їх не можна прибрати самим лише обережнішим повторенням синтезу: частина домішок хімічно надто близька до цільової молекули і вимагає окремого фізичного розділення після того, як реакція вже завершена [3].

Очищення: як відділяють цільову молекулу від домішок

Розділення виконують препаративною рідинною хроматографією зі зворотною фазою, тим самим фізичним принципом, який пізніше застосує аналітична HPLC для вимірювання чистоти, тільки в масштабі, розрахованому на реальну кількість матеріалу, а не на мікролітрову пробу. Суміш проганяють через колонку з гідрофобним сорбентом і вимивають градієнтом розчинника зростаючої концентрації. Молекули утримуються на сорбенті по-різному залежно від власної гідрофобності, тож цільовий пептид і найближчі до нього за структурою домішки виходять із колонки в дещо різний час.

Класична робота з препаративної зворотно-фазової хроматографії пептидів ще у 1984 році показала, що метод масштабується від мікрограмових до багатограмових завантажень без істотної втрати розділювальної здатності [4]. Саме ця властивість зробила його галузевим стандартом для синтетичних пептидів, а не лабораторною цікавинкою. Фракції, що виходять із колонки, збирають окремо й перевіряють: далі, до аналізу, іде тільки та частина, де переважає цільовий пік.

Розділення близькоспоріднених домішок ніколи не буває ідеальним за одну хроматографічну процедуру. Тому очищений матеріал усе одно потребує вимірювання: скільки цільової речовини лишилося після розділення і чи не потрапило туди щось стороннє. Відповідь на це дає вже не препаративна, а аналітична частина процесу.

Що йде далі

Синтез і очищення відповідають на питання «як зробити пептид», а не на питання «що саме вийшло». На друге відповідають аналітична HPLC та мас-спектрометрія: перша вимірює частку цільового піка серед решти, друга підтверджує, що виміряна маса відповідає розрахованій для заданої послідовності. Обидва методи докладно розібрано в гіді щодо читання COA пептиду. Результати цих вимірювань лабораторія оформлює як документ на конкретну партію, а що саме такий документ підтверджує і чого не підтверджує, розказано в матеріалі про те, що доводить сертифікат аналізу.

Коротко про будову пептиду, класи молекул і весь шлях від синтезу до сертифіката розказано на сторінці «Що таке пептиди» бренду Tripept.

Каталог і перевірка

Дивіться каталог дослідницьких пептидів. Партії супроводжуються сертифікатами аналізу від незалежних сторонніх лабораторій, опублікованими у відкритому архіві COA.

Матеріал має довідковий характер, описує процес виробництва дослідницького реактиву і не є інструкцією із застосування.

Джерела

  1. Merrifield RB. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society, 1963. https://doi.org/10.1021/ja00897a025
  2. Behrendt R, White P, Offer J. Advances in Fmoc solid-phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science, 2016. https://doi.org/10.1002/psc.2836
  3. D'Hondt M, Bracke N, Taevernier L, et al. Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2014.06.012
  4. Rivier J, McClintock R, Galyean R, Anderson H. Reversed-phase high-performance liquid chromatography: preparative purification of synthetic peptides. Journal of Chromatography A, 1984. https://doi.org/10.1016/S0021-9673(01)93709-4